Gen yalıtımı veya izolasyonu, rekombinant DNA teknolojisinde, bir canlıya herhangi bir genin istenilen yön ve biçimde yeni bir düzenleme içine sokulmasındaki ilk aşamadır. Bu yöntemle ilgilenilen geni taşıyan DNA parçaları elde edilir. İşlem için değişik yollar kullanılabilir. Bu yöntemler şu şekilde sıralanabilir:
1. Genellikle kullanılan yöntemlerden biri, bir canlıdan yalıtılan ve saflaştırılan DNA moleküllerini, çift zincirli yapılarını bozmadan parçalamaktadır.
Çoğaltılması istenilen gen parçaları bu parçalardan birinin içinde bulunur. DNA'nın parçalanması için bazı mekanik (kontrollü çalkalama, ultrason uygulaması gibi) yöntemlerden yararlanılmakta birlikte, günümüzde en başarılı sonuçlar kesme enzimleri (restriksiyon endonükleazlar) ile sağlanmaktadır.
2. Diğer bir yöntem ise DNA kopyasının (cDNA) eldesidir.
Bunun için hücrelerden klonlanması amaçlanan genin transkripsiyon ürününü de içeren RNA yalıtılır. Daha sonra ters (revers) transkriptaz enzimiyle bu RNA moleküllerinin tamamlayıcısı olan DNA kopyaları çıkarılır. Meydana gelen RNA/DNA melezinin RNA kısmı enzimin ribonükleaz H aktivitesiyle hidroliz edilip yok edilir, daha sonra DNA polimeraz aktivitesiyle cDNA çift zincirli hale getirilir. Bu yöntem özellikle fazla miktarda DNA içeren karmaşık gen yapısı gösteren ve çoğu geninde intron bulunan ökaryotik canlılardan gen yalıtımı için kullanılmaktadır. Elde edilen DNA parçalarının içinde bazıları çoğaltılmak istenilen gen parçasını taşırlar. Farklılaşmış ve çok az çeşitte proteinlerin sentez edildiği hücrelerde ise bu olasılık daha yüksek olur. Bu yöntem özellikle ökaryotik genlerin prokaryotlara klonlanmasında kullanılmaktadır.
3. Son yıllarda çok başarılı sonuçlar sağlayan başka bir yöntem de, Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) ile gen yalıtımıdır.
1986 yılında geliştirilen PCR yöntemi DNA moleküllerindeki istenilen gen bölgesinin canlı hücre içine sokulmadan yalıtılıp çoğaltılmasına olanak verir. Genomdan seçilen küçük miktardaki bir gen bölgesinin bile milyonlarca kopyası bu yöntemle yapılabilmektedir. Bunun için sadece bu dizinin, en azından bir kısmının önceden biliniyor olması gerekmektedir. PCR ürünü DNAlar klonlamanın yanı sıra dizi analizi, hastalık tanısı, genetik tarama gibi çeşitli amaçlar için de kullanılabilmektedir. PCR, rekombinant DNA teknolojilerinin etkinliğini ve gücünü arttırmış, hatta bazı yöntemlerin yerini almıştır.
1. Genellikle kullanılan yöntemlerden biri, bir canlıdan yalıtılan ve saflaştırılan DNA moleküllerini, çift zincirli yapılarını bozmadan parçalamaktadır.
Çoğaltılması istenilen gen parçaları bu parçalardan birinin içinde bulunur. DNA'nın parçalanması için bazı mekanik (kontrollü çalkalama, ultrason uygulaması gibi) yöntemlerden yararlanılmakta birlikte, günümüzde en başarılı sonuçlar kesme enzimleri (restriksiyon endonükleazlar) ile sağlanmaktadır.
2. Diğer bir yöntem ise DNA kopyasının (cDNA) eldesidir.
Bunun için hücrelerden klonlanması amaçlanan genin transkripsiyon ürününü de içeren RNA yalıtılır. Daha sonra ters (revers) transkriptaz enzimiyle bu RNA moleküllerinin tamamlayıcısı olan DNA kopyaları çıkarılır. Meydana gelen RNA/DNA melezinin RNA kısmı enzimin ribonükleaz H aktivitesiyle hidroliz edilip yok edilir, daha sonra DNA polimeraz aktivitesiyle cDNA çift zincirli hale getirilir. Bu yöntem özellikle fazla miktarda DNA içeren karmaşık gen yapısı gösteren ve çoğu geninde intron bulunan ökaryotik canlılardan gen yalıtımı için kullanılmaktadır. Elde edilen DNA parçalarının içinde bazıları çoğaltılmak istenilen gen parçasını taşırlar. Farklılaşmış ve çok az çeşitte proteinlerin sentez edildiği hücrelerde ise bu olasılık daha yüksek olur. Bu yöntem özellikle ökaryotik genlerin prokaryotlara klonlanmasında kullanılmaktadır.
3. Son yıllarda çok başarılı sonuçlar sağlayan başka bir yöntem de, Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) ile gen yalıtımıdır.
1986 yılında geliştirilen PCR yöntemi DNA moleküllerindeki istenilen gen bölgesinin canlı hücre içine sokulmadan yalıtılıp çoğaltılmasına olanak verir. Genomdan seçilen küçük miktardaki bir gen bölgesinin bile milyonlarca kopyası bu yöntemle yapılabilmektedir. Bunun için sadece bu dizinin, en azından bir kısmının önceden biliniyor olması gerekmektedir. PCR ürünü DNAlar klonlamanın yanı sıra dizi analizi, hastalık tanısı, genetik tarama gibi çeşitli amaçlar için de kullanılabilmektedir. PCR, rekombinant DNA teknolojilerinin etkinliğini ve gücünü arttırmış, hatta bazı yöntemlerin yerini almıştır.
